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淀粉水解培养基灭菌方法 培养基灭菌常用方法

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淀粉水解培养基灭菌方法 培养基灭菌常用方法

培养基灭菌的方法有哪些

培养基的灭菌方法

1、高压蒸汽灭菌:

高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。培养基在爱制备过程中混入各种杂菌,分装后应立即灭菌,至少应在24h内完成灭菌工作。灭菌时一般是在0.105MPa压力下,温度121℃时,灭菌15~30min即可。消毒时间不宜过长,也不能超过规定的压力范围,否则有机物质特别是维生素类物质就会在高温下分解,失去营养作用,也会使培养基变质、变色,甚至难以凝固。将蒸馏水或自来水装在三角瓶中,装水量一般不超过瓶的2/3,用牛皮纸或硫酸纸包扎封口,然后放入高压锅中灭菌后即为无菌水。 灭菌后的培养基可放到培养室中预培养3d,若无污染现象,则证明灭菌是彻底的,可以使用。暂时不用的培养基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培养基应在1周内用完,其他培养基最多也不要超过1个月。

2、过滤灭菌:

一些植物生长调节剂及有机物,如IAA、GA3、ZT、CM等,遇热容易分解,不能与培养基一起进行高温灭菌,而要使用细菌过滤器滤去其中的杂菌。细菌过滤器与滤膜(孔径0.45微米)使用之前要先进行高压灭菌。过滤后的溶液要立即加入培养基中,若为液体培养基,可在培养基冷却至30℃时加入;若为固体培养基,必须在培养基凝固之前(50-60℃)加入,振荡使溶液与其他成分混合均匀。

常用灭菌方法有哪些?各有何特点?

(1)加热灭菌法

利用高温来杀死微生物(超过最高生长温度)的方法。加热灭菌的原理:当高温作用于微生物时,首先引起细胞内生理生化反应速率加快,机体内对温度敏感的物质如蛋白质、核酸等,随着温度的增高而遭受不可逆的破坏,尽而导致细胞内原生质体的变化、酶结构的破坏,从而使细胞失去了生活机能上的协调,停止了生长发育。随着高温的继续作用,细胞内原生质便发生凝固,酶结构完全破坏,活动消失,生化反应停止,渗透交换等新陈代谢活动消失,细胞死亡。加热灭菌可分干热灭菌和湿热灭菌两大类。

1)干热灭菌 利用灼烧或干热空气灭菌而没有饱和水蒸气参加的灭菌法称为干热灭菌法。由于干热灭菌使用方便,方法简单,故在生产上广泛应用。如火焰灭菌法:直接利用火焰把微生物烧死,故又称焚烧灭菌法。采用此法灭菌既彻底又迅速,但只适用于金属制的接种工具、试管口及污染物品等的处理。热空气灭菌法:即在电热恒温干燥箱中利用干热空气来灭菌。

2)湿热灭菌 即利用蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌又分为高压、常压、间歇灭菌和巴氏灭菌4种。

①高压蒸汽灭菌 由于高压蒸汽具有较强的穿透力和较常压高的温度,能大大缩短灭菌时间,提高工作效率,加之蛋白质在湿热条件下容易变性,在热蒸汽条件下,细菌的芽孢在120℃,经20~30分钟可全部被杀死。如灭菌材料体积较大,不易被穿透时,可将压力增加到0.152兆帕,延长至1~2小时。在高压蒸汽灭菌中,灭菌温度随蒸汽压力的增加而升高(图2-6)。

图2-6 高压蒸汽灭菌锅

在使用高压灭菌锅时,要完全排出锅内的空气而以饱和蒸汽代之。如果空气不排除干净,则锅内温度将低于同样压力下由纯饱和蒸汽产生的温度,影响灭菌效果。

此法适用于各种耐热物品的灭菌,如一般培养基、生理盐水等各种溶液、玻璃器皿、工作服等。所采用的蒸汽压力与时间,应根据待灭菌物品的性质、体积与容器类型等决定。

②常压蒸汽灭菌 这是采用自然压力、100℃蒸汽进行灭菌的方法。它设备简单、成本低,当前使用最广泛。只要砌一个炉灶,买1~2只大锅,上面用砖和水泥砌成,也可用大铁桶、木桶等,体积大小可自行决定,但不宜过大,以装800~1500瓶为好。设计常压灶时应注意的问题:大小根据生产规模来定,灶顶部最好制成拱圆形,这样冷凝水可沿灶的内壁下流而不会打湿棉塞;灶仓内要有层架结构,以便分层装入灭菌物;灶上应安装温度计,可随时观察灶内温度的变化;因灭菌时间长,锅内水不够蒸发,故容量大的灶要安装加水装置;灶仓的密闭程度要尽可能高,这样既提高灭菌效果,又节省燃料。菇农在生产中还常用一种小型蒸汽发生装置,引出蒸汽后直接通到下边用木条堑起、四周用多层塑料布密封的菌袋堆中进行常压灭菌。这种方法不用建灶,简便省工(图2-7)。常压灭菌一般水烧开后保持8~10小时,闷一夜即可。

图2-7 简易常压灭菌法

③常压间歇蒸汽灭菌法 这是利用常压蒸汽反复几次灭菌的方法。具体做法是将待灭菌物品放在锅内,100℃处理1小时左右,杀死微生物的营养细胞,让其冷却至30℃左右,此时芽胞会萌发,再以同样方法加热处理,反复3次,可达到灭菌目的。该方法可用于不耐高温的药品、营养物、特殊培养基的灭菌。

④低温巴氏灭菌法 即在60~70℃下,经一定时间,杀死有害微生物的方法。适应于不耐高温的物品消毒。有些培养基,在高温下遭到破坏,用此法既可杀死致病微生物的营养体,又能使培养基的成分不致受到严重破坏。食用菌生产中培养料堆积发酵工艺,就是利用这个原理杀死其中的病虫、杂菌。

(2)过滤除菌法

又分液体过滤和空气过滤两种,就是采用机械的方法,设计一种滤孔比细菌还小的筛子,做成各种过滤器,通过机械过滤,只让液体培养基或空气从筛孔流出,各种微生物菌体则留在筛子上,从而达到除菌的目的。这种方法适用于对热不稳定的体积小的液体培养基(如动物血清、蛋白质、酶、维生素等)及气体的灭菌。超净工作台的工作原理就是将带菌空气通过过滤灭菌形成无菌空气,从风洞中吹出,来造成工作台范围的无菌状态。过滤灭菌的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。常用的过滤器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的,也有用火棉胶、硝化纤维素滤膜制成的。

(3)辐射灭菌法

利用辐射产生的能量进行杀菌的方法称辐射灭菌。辐射可分电离辐射和非电离辐射两种,α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线、中子和质子、微波等属电离辐射,紫外线、臭氧、日光为非电离辐射。

1)紫外线灭菌 紫外线杀菌的原理是利用紫外线的辐射作用。用灯管直接照射细菌使其发生光化学反应,将细菌细胞质诱导形成胸腺嘧啶双聚体,从而抑制DNA的复制而发生变性、致死。另一方面,空气在紫外线照射下产生的臭氧(O3),也具有一定的杀菌作用。紫外线的有效作用距离为1.2~2.0米。紫外灯一般悬吊在接种室或培养室的上方,个数依房间大小而定,容1~2个人操作的接种室,安装一个30瓦的紫外灯就可以了。在每次接种前,应将所需的器具一起放入接种室(箱)内,然后打开紫外灯照射。如果接种室体积较大,开灯照射2小时才能达到灭菌效果;如果较小,只需开灯半小时左右既可达到灭菌效果。由于紫外线穿透力弱,即使是普通玻璃也不能滤过,因此,只适于空气或物体表面的灭菌。紫外线对人体皮肤,尤其是眼睛有杀伤作用,应避免直视,工作时应将紫外灯关闭。紫外线消毒时工作场所如果处在稍暗无光的情况下,能提高杀菌效果。细菌接受致死量紫外线照射后,随即给予可见光照射,部分细菌有复活的可能。干细胞比湿细胞对紫外线的抗性强,孢子比其营养细胞对紫外线更具抗性。

2)微波灭菌 由于微生物的细胞中都含有70%~90%的水分,水分子在微波电场中被极化,并随着电场方向的改变而转动,在转动过程中分子之间高速度摩擦产生热能,这种热能不同于外部加热,可在短时间里使细胞爆破而物体本身的温度却只有极微增加,从而达到灭菌效果。用YM7601型微波炉只需60秒钟就能杀死食品中192万个大肠杆菌。

3)臭氧发生器消毒 臭氧(O3)具有强烈的氧化作用,能破坏微生物的细胞膜与核酸。O3也是一种暂态物质,常温下能自然分解,还原成氧。其灭菌原理实际上和紫外线消毒极相似。

常用的灭菌方法有哪几种

常用的灭菌方法有湿热灭菌法,干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过虑灭菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。只要物品允许,应尽可能选用最终灭菌法灭菌。

常用的消毒灭菌的方法有哪些

消毒灭菌的方法 (一)物理消毒灭菌法

利用物理因子杀灭微生物的方法.包括热力消毒灭菌、辐射消毒、空气净化、超声波消毒和微波消毒等。

1.热力消毒灭菌

高温能使微生物的蛋白质和酶变性或凝固(结构改变导致功能丧失),新陈代谢受到障碍而死亡,从而达到消毒与灭菌的目的.在消毒中,热可分为湿热与干热两大类。

干热是指相对湿度在20%以下的高热,干热消毒灭菌是由空气导热,传热效果较慢.一般繁殖体在干热80-100℃中经1小时可以杀死,芽胞需160-170℃经2小时方可杀死。 (1)燃烧法

是一种简单、迅速、彻底的灭菌方法,因对物品的破坏性大,故应用范围有限。

烧灼法:一些耐高温的实验器械(金属、搪瓷类),在急用或无条件用其他方法消毒时可采用此法.将器械放在火焰上烧灼1-2分钟.若为搪瓷容器,可倒少量95%乙醇,慢慢转动容器,使乙醇分布均匀,点火燃烧至熄灭约1-2分钟.采集作细菌培养的标本时,在留取标本前后(即启盖后,闭盖前)都应将试管(瓶)口和盖子置于火焰上烧灼,来回旋转2-3次。

燃烧时要注意安全,须远离易燃易爆物品,如氧气、汽油、乙醚等.燃烧过程不得添加乙醇,以免引起火焰上窜而致灼伤或火灾.锐利刀剪为保护刀锋,不宜用燃烧灭菌法。

焚烧:某些特殊感染,如破伤风、气性坏疽、绿脓杆菌感染的敷料,以及其它已污染且无保留价值的物品,如污纸、垃圾等,应放入焚烧炉内焚烧,使之炭化。 (2)干烤法

电热烤箱:利用烤箱的热空气消毒灭菌。烤箱通电加热后的空气在一定空间不断对流,产生均一效应的热空气直接穿透物体.一般繁殖体在干热80-100℃中经1小时可以杀死,芽胞、病毒需160-170℃经2小时方可杀死.热空气消毒灭菌法适用于玻璃器皿、瓷器以及明胶海棉、液体石腊、各种粉剂、软膏等.灭菌后待箱内温度降至50-40℃以下才能开启柜门,以防炸裂。

微波消毒:微波是一种高频电磁波,其杀菌的作用原理,一为热效应,所及之处产生分子内部剧烈运动,使物体里外湿度迅速升高;一为综合效应,诸如化学效应、电磁共振效应和场致力效应。目前已广泛应用于食品、药品的消毒,用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用品等亦有报告.若物品先经1%过氧乙酸或0.5%新洁尔灭湿化处理后,可起协同杀菌作用,照射2分钟,可使杀芽胞率由98.81%增加到99.98%-99.99%。

微波对人体有一定危害性,其热效应可损伤眼睛晶状体等,长时间照射还可致神经功能紊乱.使用时可设置不透微波的金属屏障或戴特制防护眼境等。

湿热消毒灭菌

由空气和水蒸气导热,传热快,穿透力强,湿热灭菌法比干热灭菌法所需温度低、时间短。

(1)煮沸法

将水煮沸至100℃,保持5-10分钟可杀灭繁殖体,保持1-3小时可杀灭芽胞.在水中加入碳酸氢钠至1%-2%浓度时,沸点可达105℃,能增强杀菌作用,还可去污防锈.在高原地区气压低、沸点低的情况下,要延长消毒时间(海拔每增高300m,需延长消毒时间2分钟).此法适用于不怕潮湿耐高温的搪瓷、金属、玻璃、橡胶类物品。

煮沸前物品涮洗干净,打开轴节或盖子,将其全部浸入水中.大小相同的碗、盆等均不能重叠,以确保物品各面与水接触.锐利、细小、易损物品用纱布包裹,以免撞击或散落.玻璃、搪瓷类放入冷水或温水中煮;金属、橡胶类则待水沸后放入.消毒时间均从水沸后开始计时.若中途再加入物品,则重新计时,消毒后及时取出物品,保持其无菌状态。

经煮沸灭菌的物品.“无菌”有效期不超过6小时。 (2)高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌器装置严密,输入蒸汽不外逸,温度随蒸汽压力增高而升高,当压力增至103-206kPa时,湿度可达121.3-132℃.高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌,为目前可靠而有效的灭菌方法.适用于耐高温、高压,不怕潮湿的物品,如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等。

潜热是指当lg100℃的水蒸汽变成lg100℃水时,释放出2255.2J的热量。 高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件,而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出.因为冷空气导热性差,阻碍蒸汽接触欲灭菌物品,并且还可减低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。

手提式高压蒸汽灭菌器:为金属圆筒,分为二层,隔层内盛水,有盖,可以旋紧,加热后产生蒸汽。锅外有压力表,当蒸汽压力升高时,温度也随之相应升高。该灭菌器体积小,可自发蒸汽,便于携带。

操作方法如下:在灭菌器中盛水3000ml;将拟灭菌的物品随同盛装的桶放入灭菌器内;将盖子上的排气软管插于铝桶内壁的的方管中;盖好盖子,拧紧元宝螺丝,勿使漏气;锅下加热,打开排气活门,放出冷空气(一般在水沸后排气10-15分钟左右),关闭放气活门,使压力逐渐上升至103kPa,温度达121.3℃,维持20分钟后,排气至“0”时,慢慢打开盖子.如果突然开盖,冷空气大量进入,蒸汽凝成水滴,使物品潮湿,且玻璃类易发生爆裂。

卧式高压蒸汽灭菌器:其结构原理同手提式高压蒸汽灭菌器,因其体积大,一次可灭菌大量物品.操作人员须经专业培训,再关闭放气开关,待夹层压力表达到灭菌所需压力时(约10分钟后),将蒸汽控制阀移至“消毒”位置,使蒸汽进入柜室 ,柜室内的冷空气及冷凝水可由柜室阻气器排出,待柜室的压力升到103-137kPa,温度达121.3~126.2℃时,转动压力调节阀,使压力与温度保持恒定.维持30分钟后,将蒸汽控制阀移至“排气”位置,排气毕,将蒸汽控制阀移至“干燥”位置;物品干燥后,将蒸气控制阀移至“关闭”位置,待压力指针到“0”位置和热空气排尽后,才能打开柜门,取出物品;关紧进气阀。

预真空式高压蒸汽灭菌器:在通入蒸汽前有一预处理阶段,即柜室内抽负压至2.6kPa(空气排除约98%),所以,预真空高压蒸汽灭菌器除有下排气式所具备的灭菌系统、蒸汽输送系统、控制系统、安全系统和仪表监测指示系统外,增加抽负压系统和空气过滤系统.机器运转由电脑控制。

再关闭放气开关,待夹层压力表达到灭菌所需压力时(约10分钟后),将蒸汽控制阀移至“消毒”位置,使蒸汽进入柜室 ,柜室内的冷空气及冷凝水可由柜室阻气器排出,待柜室的压力升到103-137kPa,温度达121.3~126.2℃时,转动压力调节阀,使压力与温度保持恒定.维持30分钟后,将蒸汽控制阀移至“排气”位置,排气毕,将蒸汽控制阀移至“干燥”位置;物品干燥后,将蒸气控制阀移至“关闭”位置,待压力指针到“0”位置和热空气排尽后,才能打开柜门,取出物品;关紧进气阀。 操作方法如下:打开蒸汽管道阀门,首先将柜室夹层和管道内的空气和积水排净,使夹套内达到预定压力和温度(104-167℃),将待灭菌物品装入柜室,关紧柜门.柜室内抽负压至2.6kPa,向柜室内输入蒸汽,将控制阀移至“消毒”的位置.随后机器按一定程序自动运行,诸如:“恒温”、“排气”、“干燥”、“关闭”等.待恢复常压后打开柜门取出物品.灭菌时使压力达206kPa,温度为132℃,维持4-5分钟.

实验室常用的灭菌方法有干热灭菌.高压蒸汽灭菌.紫外线灭菌.过滤除菌四种?各有那些优缺点

1.高压蒸汽灭菌

为湿热灭菌方法的一种。是微生物培养中最重要的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水在煮沸时所形成的蒸汽不能扩散到外面去,而聚集在密封的容器中,在密闭的情况下,随着水的煮沸,蒸汽压力升高,温度也相应增高。压力和温度之间的关系见表9-1。

高压蒸汽是最有效的灭菌法,能迅速地达到完全彻底灭菌。一般在15磅/英寸2压力下(121.6℃),15~30分钟,所有微生物包括芽孢在内都可杀死。它适用于对一般培养基和玻璃器皿的灭菌。

进行高压蒸汽灭菌的容器是高压蒸汽灭菌锅。高压蒸汽灭菌锅是一个能耐压又可以密闭的金属锅,有立式与卧式两种。

可以用电热、煤气、蒸汽等。锅上装有压力表,有的还装有温度计,能及时了解锅内压力及温度。锅上还设有排气口,其作用是在密闭之前,利用蒸汽将锅内的冷空气排净,另外还装有安全活门,如果压力超过一定限度,活门即可自动打开,放出过多的蒸汽。

2.干热灭菌

微生物培养中常用的干热灭菌是指热空气灭菌。一般在电烘箱中进行。干热灭菌所需温度较湿热灭菌高,时间也较湿热灭菌长。这是因为蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固。一般须在160℃左右保持恒温3~4小时,方能达到灭菌的目的。

干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌,凡带有橡胶的物品和培养基,都不能进行干热灭菌。

3.间歇灭菌

各种微生物的营养体在100℃温度下半小时即可被杀死。而其芽孢和孢子在这种条件下却不会失去生活力。间歇灭菌就是根据这一原理进行的。

间歇灭菌的方法是用100℃、30分钟杀死培养基内杂菌的营养体,然后将这种含有芽孢和孢子的培养基在温箱内或室温下放置24小时,使芽孢和孢子萌发成为营养体。这时再以100℃处理半小时,再放置24小时。如此连续灭菌3次,即可达到完全灭菌的目的。

间歇灭菌通常在流动蒸汽的灭菌锅中进行,也可用普通铝锅代替。这种灭菌方法多用于明胶、牛乳等物质的灭菌,这类物质在100℃以上的温度下处理较长时间,会被破坏,而用间歇灭菌法就既起到了杀菌作用,又使被处理的物质免遭破坏。

4.紫外线灭菌

紫外线杀菌力最强的是波长2650~2660Å的部分。无菌室缓冲间和接种箱常用紫外线灯作空气灭菌。无菌室和缓冲间的照射时间为20~50分钟(视房间大小而定),接种箱照射10~15分钟即可。

为了加强紫外线灭菌的效果,在照射前,可在无菌室、缓冲间或接种箱内喷洒5%石炭酸,以使空气中附着有微生物的尘埃降落,同时也可以杀死一部分微生物。无菌室的工作台的台面和椅子,可用2~3%的来苏儿擦洗。然后再照射紫外线。由于紫外线对人体有伤害作用,所以人不要直视正在照射的紫外线灯,也不要在照射情况下进行工作。

灭菌后,为了检验紫外线的灭菌效果,可以在无菌室、缓冲间或接种箱内放一套盛有培养基的培养皿,将皿盖打开5~10分钟,盖好后,放入温箱中培养。如果只有一、二个菌落,可认为灭菌效果良好。如杂菌丛生。则需延长照射时间或同时加强其它灭菌措施。

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